Untersuchungen Molekulare­ Hämato-Onkologie

Gen(e): BCR-ABL-Transfusion
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Bei einer bestehenden hohen BCR-ABL-positiven Resterkrankung unter Therapie wird der Ausschluß einer mutationsbedingten Resistenz empfohlen.
Unter Therapie mit dem BCR-ABL-Kinase-Inhibitor Imatinib kann sich eine Resistenz entwickeln, die auf Mutationen in der ABL-Kinasedomäne (Exon 4-7) zurückzuführen ist. Die Mutationen zeigen distinkte Muster. So decken 17 gut charakterisierte Mutationen in der ABL-Kinasedomäne über. 85% aller resistenz-assoziierten Mutationen ab. 
Der Nachweis einer Mutation indiziert einen Wechsel des Therapieschemas und Einsatz alternativer Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI).

Indikation: V. a. resistenz-assoziierte Mutation bei CML
Mutation: ABL-Kinasedomain-Mutationen
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Sequenzierung

Gen(e): AML-ETO-Fusionsgen
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die molekularen Ursachen für die Entstehung einer akuten myeloischen Leukämie (AML) sind vielfältig. Mit bis zu 12 % aller Fälle gehört die chromosomale Translokation t(8;21)(q22q22) zu der häufigsten Form. Die Prognose der betroffenen Patienten ist eher günstig.
Durch diese Translokation an konservierten Bruchpunkten werden Teilabschnitte der Gene AML1 (=RUNX1) und ETO (=RUNX1T1) zu einem Fusionsgen verschmolzen mit konstitutiver Expression eines Fusionstranskripts AML-ETO. Dieses Fusionsprodukt beeinflusst über Protein-Protein-Interaktionen die Komponenten des CBF (core binding factor) Transkriptionsfaktor-Komplexes. Funktionell soll hierdurch u.a. das interne DNA-Repair-System unterdrückt werden, so dass es zu einer Ansammlung von somatischen Mutationen kommt.


Indikation: V. a. akute myeloische Leukämie (AML)
Mutation: AML-ETO-Fusionsgen
Material: 2 –5 ml EDTA-Blut Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 2 Tage
Methode: PCR; Real-time-PCR

Gen(e): AML1-ETO; PML-RARA; NPM1-MLF1; CBFB-MYH11; BCR-ABL_b2a3; AF10_240-CALM_2092; DEK-CAN; MLL-PTD; MILL
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Screening auf die mit Abstand häufigsten Fusionsproteine bzw. Translokationen bei Vorliegen einer akuten myeloischen Leukämie.

Indikation: Risikotratifizierung der AML
Mutation: AML1-ETO; PML-PARA; NPM1-MLF1; CBFB-MYH11; BCR-ABL_b2a3; AF10_240-CALM_2092; DEK-CAN; MLL-PTD; MLL-AF9
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blu; EDTA-KM
Dauer der Untersuchung: ca. 1– 2 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese

Gen(e): BCR-ABL Fusionsgen (OMIM 151410)
Erbgang: somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die Chronisch Myeloische Leukämie (CML) zeigt in ca. 95 % aller Fälle auf molekularer Ebene eine chromosomale Translokation t(9;22) (q34;q11), die auch als Philadelpia-Chromosom oder -Translokation bezeichnet wird. Durch dieses Bruchereignis wird der C-terminale Bereich des Gens für die Tyrosinkinase c-ABL auf Chromosom 9 mit dem Promotorbereich des BCR-Gens auf Chromosom 22 fusioniert. Aufgrund fehlender Regulationsmechanismen wird das Fusionsgen, bzw. die Tyrosinkinasedomäne von c-ABL konstitutiv exprimiert, was über den zugehörigen Signaltransduktionsweg die Proliferation stimuliert und die Apoptose einschränkt.
Betroffene Patienten werden nach Erstdiagnose nach Therapieleitlinien mit Kinase-Inhibitoren (z. B. Imatinib) behandelt und der Therapie-Erfolg durch regelmäßiges Monitoring bezüglich eines quantitativen Rückgangs der Fusionstranskripte überprüft. Der jeweilige Anteil der BCR-ABL-Fusionstranskripte in Bezug auf das unmutierte ABL-Transkript in den Zellen wird – unabhängig von der eingesetzten Methode – als International Scale (IS) angegeben und ist somit allgemein vergleichbar.

Indikation: V. a. CML, ALL, AML
Mutation: Nachweis des BCR-ABL-Fusionstranskripts
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: 1– 3 Tage
Methode: RNA-Extraktion; reverse Transkription; RT-PCR

Gen(e): BRAF
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Das Gen BRAF kodiert für die Serin-Threonin-Proteinkinase B-Raf mit funktioneller Bedeutung im MAP-Kinase- und im Ras-Raf-Signalweg für eine Wachstumsregulation der Zelle. Durch Mutation wird das Molekül konstitutiv aktiviert, was zu unkontrolliertem Zellwachstum führt. BRAF-Mutationen finden sich in diversen Tumoren, u. a. in geschätzt 60 % aller Melanome.
Als spezifischer Biomarker dient die Mutation BRAF-p.V600E für eine Haarzell-Leukämie, die u. a. gekennzeichnet ist durch mononukleäre Zellen mit „haarigen“ Zytoplasmafortsätzen.

Indikation: V. a. Haarzell-Leukämie (HCL)
Mutation: BRAF V600
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR

Gen(e): CBFbeta-MYH11-Fusionsgen
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die molekularen Ursachen für die Entstehung einer akuten myeloischen Leukämie (AML) sind vielfältig. Mit bis zu 5 % aller Fälle gehört die chromosomale Inversion , inv(16)(p13;q22), bzw. die Translokation t(16;16)(p13;q22) zu den häufigeren Formen, insbesondere bei jugendlichen Erwachsenen.
Durch diese Translokation an konservierten Bruchpunkten werden Teilabschnitte eines Muskelgens (smooth muscle myosin-heavy chain gene) MYH11 und dem core binding factor beta CBFbeta, einem Bestandteil des core binding factor Transkriptionsfaktor-Komplexes, zu einem Fusionsgen verschmolzen mit konstitutiver Expression eines Fusionstranskripts CBFbeta-MYH11. Dieses Fusionsprodukt interagiert mit nukleären Co-Repressormolekülen und führt so in der mutierten Zelle zu einer Dysregulation der Transkription.
Betroffene Patienten haben eine günstige Prognose, besonders bei einer intensiven Postremissions-Therapie und quantitativem Monitoring einer MRD (minimal residual disease).

Indikation: V. a. akute myeloische Leukämie (AML)
Mutation: CBFbeta-MYH11-Fusionsgen
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 2 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR

Gen(e): CEBPA
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Der Nachweis von Translokationen wird als wichtigster unabhängiger Prognosefaktor bei der AML gewertet. Bei ca. 45 % der Patienten jedoch finden sich keine Translokationen oder weitere cytogenetische Auffälligkeiten. Auch für diese Patientengruppen wurden in den vergangenen Jahren vermehrt Mutationen oder zytogenetisch nicht detektierbare Rearrangements publiziert, die zu einer Prognosefindung beitragen. Hier sind vor allem die Gene NPM1, FLT3, CEBPA und MLL zu nennen, für die distinkte, rekurrente Mutationen mit prognostischer Bedeutung beschrieben sind.
CEBPA, auch CAAT/enhancer binding protein genannt, gehört zur Gruppe der sogen. Leucine-zipper (bZIP) Transkriptionsfaktoren, die nach Dimerisierung und DNA-Bindung 2 Transaktivierungsdomänen aktivieren. Durch Regulation der Genexpression während der Myelopoese übt CEBPA eine wichtige Funktion für die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen aus. In Studien wurde bei Nachweis einer CEBPA-Mutation und gleichzeitigem Ausschluss einer FLT3-ITD-Mutation eine signifikant bessere Prognose für Patienten mit primärer AML postuliert.

Indikation: Risikostratifizierung der AML
Mutation: CEBPA
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut; EDTA-KM
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Real-time PCR

Gen(e): Versch. Mikrosatelliten

Klinische Bedeutung:

Nach konventioneller Stammzelltransplantation (SCT) bei gleichzeitig myeloablativer Vorbehandlung des Patienten werden bei erfolgreicher Behandlung ca. 4 Wochen lang noch Zellen vom Patienten (Empfänger) und vom Spender im peripheren Blut nachgewiesen (sogen. gemischter Chimärismus). Die Zellen von Spender und Empfänger werden zuvor hinsichtlich Variabilität, d. h. Unterscheidbarkeit im DNA-Muster, typisiert. Hierzu werden definierte, hypervariable Mikrosatelliten mittels STR-PCR getestet. Aufgrund der Ausgangsdaten lassen sich im Elektropherogramm nach SCT zu den jeweiligen Mikrosatelliten die Fragmente dem jeweiligen Spender- oder Empfängerorganismus zuweisen und auch semiquantitativ bestimmen. Sind die Fragmente des Empfängerorganismus nach erfolgreicher Behandlung nicht mehr nachweisbar, so wird dies als kompletter Chimärismus definiert.
Mittels der genannten STR-PCR kann ein Therapiemonitoring erfolgen.


Indikation: Z. n. Stammzelltransplantation
Mutation: Mikrosatelliten-Profile
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Fragmentlängenbestimmung

Gen(e): E2A-PBX1-Fusionsgen
Erbgang: i.d.R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die molekularen Ursachen für die Entstehung einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) sind vielfältig. Mit bis zu 23 % bei pädiatrischen pre-B-Zell-Leukämien und bis zu 3 % adulter Fälle gehört die chromosomale Translokation t(1;19)(q23;p13.3) zu den häufigeren Formen einer pre-B-Zell-Leukämie.
Durch diese Translokation an konservierten Bruchpunkten werden Teilabschnitte der Gene basic helix loop helix transcription factor E2A und dem Gen für das homeo-domain protein PBX1 zu einem Fusionsgen verschmolzen mit konstitutiver Ex-pression eines Fusionstranskripts E2A-PBX1. E2A ist ein Regulator der Lympho-zyten-Differenzierung, PBX1 ist ein homeodomain-containing HOX cofactor. Durch die Fusion wird die Transaktivierungsdomäne von E2A mit der DNA-Bindungs-domäne von PBX1 so kombiniert, dass funktionell die Differenzierung bzw. Reifung der lymphoiden Zellreihe gestört ist und es zu einer Expansion undifferenzierter Vorläuferstufen kommt.

Indikation: V. a. akute lymphoblastische Leukämie (ALL)
Mutation: E2A-PBX1-Fusionsgen
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR

Gen(e): EPOR
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Erhöhte Laborwerte für Erythrozytenanzahl, Hämoglobinwerte oder Hämokrit-Wert weisen differentialdiagnostisch auf eine Polycythemia hin, verbunden mit einem erhöhten Thromboserisiko. Während die angeborene Form i. d. R. durch konstitutive, aktivierende Mutationen im Erythropoietin-Rezeptor (EPOR) bedingt wird, liegen in der sekundär erworbenen Polycythemia vera (PV) mehrheitlich Mutationen in der EPOR-Signalkaskade mit dem zentralen Molekül JAK2 zugrunde, wobei die Mutation V617F im JAK2-Gen mit ca. 95 % aller Fälle mit PV zu finden ist. In weiteren ca. 4 % findet sich eine Mutation im Exon 12 des JAK2-Gens. Erworbene Mutationen im EPOR-Gen sind eher selten, sollten aber bei klinischem V. a. PV, erniedrigtem Erythropoietin-Spiegel und negativer JAK2-Mutationsanalyse sicher ausgeschlossen sein.

Indikation: Myeloproliferative Neoplasien
Mutation: EPOR-Mutationsanalyse
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Sequenzierung

Gen(e): ETV6-RUNX1-Fusionsgen
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die molekularen Ursachen für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL) sind vielfältig. In ca. 50 % aller Fälle wird eine chromosomale Translokation detektiert. Mit bis zu 30 % bei pädiatrischen pre-B-Zell- oder B-Zell-Leukämien gehört die chromosomale Translokation t(12,21)(p32.3,q22.12) zu den häufigsten Auffälligkeiten dieser Entität. Hierdurch werden der Transkriptionsfaktor ETV6 (ein Mitglied der ets-Familie) mit dem Transkriptionsfaktor RUNX1 (= AML1 oder core binding factor A) fusioniert. Während ETV6 ein mehr allgemeiner Transkriptionsaktivator mit HLGH- und ETS-Domäne ist, ist RUNX1 durch Bindung an Promotoren und Enhancer ein spezifischer Aktivator für Hämatopoese-spezifische Gene. Durch die Fusion erfolgt eine verstärkte Transkriptionsaktivierung.
Für die meisten Patienten bedeutet der Nachweis eines ETV6-RUNX1-Fusionstrans-kriptes bei Erstdiagnose ein sehr gutes Therapie-Ansprechen und eine günstige Prognose.

Indikation: V. a. prädiatrische pre-B-Zell- oder B-Zell-Leukämien
Mutation: ETV6-RUNX1-Fusionsgen
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR

Gen(e): IgVH-Cluster
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Patienten mit einer CLL sind i. d. R durch klonal rearrangierte Immunglobulin-Gene charakterisiert. Das Auftreten einer monoklonalen B-Zell-Fraktion wird mittels Multiplex-PCR für IgVH-spezifische Rearrangements getestet und durch Sequenzierung typisiert. Prognostisch wichtig ist der Nachweis möglicher Mutationen in der variablen Region der schweren Immunoglobin-Kette. Ca. 50 % aller CLL-Patienten zeigen somatische Mutationen. Gemäß allgemeiner Richtlinien wird dabei ein Auftreten von mehr als 2 % Mutationen als „mutiert“ definiert, während 2 % oder weniger als „unmutiert“ definiert wird. Dieser Mutationsstatus hat eine prognostische Bedeutung. So zeigen Patienten mit unmutierten Immunoglobulinen eine vergleichsweise kürzere Remissionsdauer und kürzere mediane Überlebenszeit.

Indikation: V. a. klonal rearrangierte Immunglobulin-Gene bei B-CLL
Mutation: Klonalitätstestung bei B-CLL
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 4 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Sequenzierung

Gen(e): JAK2

Erbgang: somatische Mutation


Klinische Bedeutung:

Die nicht-leukämischen myeloproliferativen Erkrankungen (MPE) stellen eine Gruppe von chronischen Erkrankungen dar, deren gemeinsamer pathologischer Ursprung ein somatisches Mutationsereignis in einer Stammzelle des Knochenmarks mit anschließender klonaler Proliferation der hämopoetischen Zelllinie ist.
Eine signifikante Anzahl von Patienten hat eine somatische, aktivierende Mutation in der Kinasedomäne des JAK2-Gens, nämlich ein Aminosäureaustausch von Valin nach Phenylalanin an Position 617 (V617F). Durch die Aktivierung der JAK2-Kinase kommt es zu einem erhöhten Ansprechen auf Erythropoetin und Zytokinen, was den JAK-STAT-Signalweg aktiviert und zur Proliferation führt.
JAK2 V617F-Mutationen finden sich in 80 – 90 % der Patienten mit Polycythemia vera (PV), in ca. 40 % der Patienten mit essentieller Thrombozythämie (ET), wie auch in ca. 40 % der Patienten mit chronisch idiopathische Myelofibrose (CIMF).
Die Untersuchung dieser Mutation ist insbesondere für den Nachweis von Klonalität bei unklarer Polyglobulie oder Thrombozytose von besonderer Bedeutung, wobei ein fehlender Nachweis das Vorliegen einer myeloproliferativen Erkrankung nicht mit Sicherheit ausschließt.

Indikation: V. a. myeloproliferative Erkrankung (MPE)

Mutation: JAK2 V617F

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut

Dauer der Untersuchung: 1 – 2 Wochen

Methode: DNA-Ex

Gen(e): JAK2
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Durch Mutationen konstitutiv veränderte Tyrosinkinasen sind gemeinsame Merkmale für die Pathogenese verschiedener myeloproliferativer Erkrankungen. So ist die mit Abstand häufigste Mutation im Codons 617 des JAK2-Gens (V617F) für eine konstitutive Aktivierung der JAK2-Kinase und, als Folge, für eine pathogene Proliferation von Progenitorzellen verantwortlich. In der Hälfte der JAK2-V617F-negativen Fälle finden sich seltene, sogen. „gain-of-function“-Mutationen im Bereich Codon 536-547 von Exon 12 des JAK2-Gens, die u. a. klinisch mit einer isolierten Erythrozytose auftreten können. Durch diese Mutationen wird ebenfalls die JAK2-Kinase konstitutiv aktiviert.


Indikation: Myeloproliferative Neoplasien

Mutation: JAK2-Exon12-Mutationsanalyse

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Sequenzierung

Gen(e): Kit
Erbgang: Somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
KIT (auch stem cellfactor receptor, SCFR; CD117) stellt einen Typ III-Rezeptor mit extrazellulärer Ig-like Domäne und intrazellulärer Tyrosinkinase-Aktivität dar. Eine Expression findet sich u. a. in hämatopoetischen Stammzellen, Mastzellen, Melanozyten und Keimbahnzellen. Bei der Mastozytose des Erwachsenen weist der überwiegende Teil der Patienten die Punktmutation p.D816V im KIT-Gen auf. Diese Mutation stellt eine gain-of-function-Mutation dar, die zu einer konstitutiven Tyrosinkinase-Aktivität und Phosphorylierung von KIT führt und damit zu einer Liganden-unabhängigen Zellproliferation.
Die Klinik der Mastozytose ist sehr heterogen, u. a. kann bei einem Teil der Patienten auch die Hämatopoese betroffen sein und zu Blutbildveränderungen, wie z. B. Eosinophilie, Monozytose oder Blastenvermehrung führen. Dies ist oft als Hinweis auf eine systemische Mastozytose mit klonaler Erkrankung der Hämatopoese zu werten, wobei die assoziierten hämatologischen Erkrankungen sowohl myeloische als auch lymphatische Neoplasien sein können.

Indikation: V. a. systemische Mastozytose; Mastzellen-Leukämie
Mutation: KIT p.D816
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR

Gen(e): MLL
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Der Nachweis von Translokationen wird als wichtigster unabhängiger Prognosefaktor bei der AML gewertet. Bei ca. 45 % der Patienten jedoch finden sich keine Translokationen oder weitere cytogenetische Auffälligkeiten. Auch für diese Patientengruppen wurden in den vergangenen Jahren vermehrt Mutationen oder zytogenetisch nicht detektierbare Rearrangements publiziert, die zu einer Prognosefindung beitragen. Hier sind vor allem die Gene NPM1, FLT3, CEBPA und MLL zu nennen, für die distinkte, rekurrente Mutationen mit prognostischer Bedeutung beschrieben sind.
MLL (= ALL1) ist eine Histon-Lysin-N-Methyltransferase, die über Histonmethylierung die Expression von Zielgenen reguliert. MLL ist ein häufiges Target für chromosomale Translokationen, insbesondere bei juvenilen akuten Leukämien (70%). Eine beim Erwachsenen öfter beobachtete Mutation ist eine partielle Tandem-Duplikation (MLL-PTD), die nach Literaturangaben präferentiell transkribiert wird und zu einem partiell duplizierten MLL-Protein mit leukämischen Eigenschaften führt. Der Nachweis ist prognostisch eher ungünstig.

Indikation: Risikostratifizierung der AML

Mutation: MLL-PTD
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut; EDTA-KM
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Real-time PCR

Gen(e): MLL-AF4 -Fusionsgen
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die molekularen Ursachen für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL) sind vielfältig. Eine charakteristische Entität ist die chromosomale Translokation t(4,11)(q21,q23.3) mit einer Fusion der Gene MLL und AF4. MLL ist durch verschieden Bruchereignisse in Translokationen mit über 50 verschiedenen Genen involviert, wobei das MLL-AF4-Transfusionsgen das häufigste ist. MLL-AF4 beeinflusst den Differenzierungspathway sehr früher oder undifferenzierter Vorläuferzellen und verursacht fast ausschließlich akute lymphoblastische Leukämien (ALL) der B-Zellreihe, insbesondere pädiatrische pre-B-Zell akute lymphoblastische Leukämien.
Die Prognose ist eher ungünstig und gegebenenfalls eine Indikation für eine Knochenmarktransplantation.

Indikation: V. a. pädiatrischen pre-B-Zell- oder B-Zell-Leukämien

Mutation: MLL-AF4-Fusionsgen

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-Time PCR

Gen(e): MPL
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:

Myeloproliferative Neoplasien (MPN) sind meist mit klonalen genetischen Auffälligkeiten assoziiert, wobei die JAK2-V617F-Mutation die mit Abstand häufigste ist. Während die JAK2-negativen Fälle von PV (Polycythaemia vera) meist eine Mutation im JAK2-Exon12 haben, zeigen ca. 5 % der Fälle mit ET (essentielle Thrombozythämie) und ca. 8 % der Fälle mit PMF (primäre Myelofibrose) eine Mutation im Exon 10 des MPL-Gens, in der Regel an Position p.W515. Für die Position p.W515 sind vier Mutationen beschrieben, die entweder an der Position 515 zu einem Austausch von Tryptophan (W) zu Lysin (p.W515K), zu Leucin (p.W515L), zu Arginin (p.W515R) oder zu Alanin (p.W515A) führen.
Das MPL-Gen (auch CD110) ist der zelluläre, transmembranständige Thrombopoetin-Rezeptor, der den Liganden Thrombopoetin bindet und somit ein wichtiger Regulator der Megakaryocytopoese und Plättchen-Bildung.
Nach Bindung des Liganden Thrombopoetin an das MPL-Molekül erfolgen eine Dimerisierung des Rezeptors und eine Phosporylierung der nachfolgenden JAK-, STAT-Signalkaskade. Eine Mutation an Position p.W515 beeinflusst das wichtige amphipatische Motif RWQFP, und führt zu einer permanenten Aktivierung des Thrombopoetin-Rezeptors und damit der nachgeordneten Signalmoleküle.


Indikation: Myeloproliferative Neoplasien

Mutation: MPL-Gen Position p.W515

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-time PCR; Sequenzierung

Gen(e): Next-generation-Sequencing (NGS) hämato-onkologischer Risikogene
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Hämatologische Neoplasien ohne klassische Marker oder chromosomale Translokationen sind schwer zu diagnostizieren oder im Therapieverlauf zu verfolgen. Insbesondere Formen von AML und MDS haben oftmals Hotspotmutationen in Risikogenen, die ein Therapiemonitoring erlauben.
Der Einsatz der Next-generation-Sequencing-Methode erlaubt ein sogen. massive parallel sequencing sowohl hinsichtlich der Ziele, als auch Reaktionsanzahl (= Tiefe). Das von uns eingesetzte Panel beinhaltet die Hotspotmutationen folgender Gene:
AML1 (= RUNX1); ASXL1; CBL; CEBPA; cKIT; DNMT3A; ETV6; EZH2; IDH1; IDH2; KRAS; NPM1, NRAS; PTPN11; SF3B1; SHSB3; SRSF2; TET2; TP53; UTX; WT1 

Indikation: Risikostratifizierung und Verlaufskontrolle bei hämatologischen Neoplasien ohne cytogenetische Auffälligkeiten wie z. B. MDS oder AML

Mutation: Hotspotmutationen hämato-onkologischer Risikogene

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 3 Wochen
Methode: PCR; next-generation-sequencing

Gen(e): NPM1
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Der Nachweis von Translokationen wird als wichtigster unabhängiger Prognosefaktor bei der AML gewertet. Bei ca. 45 % der Patienten jedoch finden sich keine Translokationen oder weitere cytogenetische Auffälligkeiten. Auch für diese Patientengruppen wurden in den vergangenen Jahren vermehrt Mutationen oder zytogenetisch nicht detektierbare Rearrangements publiziert, die zu einer Prognosefindung beitragen. Hier sind vor allem die Gene NPM1, FLT3, CEBPA und MLL zu nennen, für die distinkte, rekurrente Mutationen mit prognostischer Bedeutung beschrieben sind.
NPM1, auch Nucleophosmin oder nucleoläres Phosphoprotein B23 genannt, ist ein sogen. Shuttle-Protein zwischen Kern und Cytoplasma und ist u.a. in die Regulation des ARF-TP53- Tumorsuppressorpathway involviert. In ca. 35 % aller Fälle mit primärer AML, nicht aber mit sekundärer AML, korrelierte eine Akkumulation des NPM1-Proteins im Cytoplasma mit distinkten Mutationen im C-Terminus des NPM1-Protein (ab Codon 286 im Exon 12 des Gens), welche die Relokalisation des NPM1-Proteins ins Cytoplasma bedingen (Fellini, NEJM 2005). Als einzelne Mutation mit eher günstiger Prognose.

Indikation: Risikostratifizierung der AML
Mutation: NPM1-C-terminus

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut; EDTA-KM
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Real-time PCR

Gen(e): PML-RARA-Transfusion
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Die akute Promyelozyten-Leukämie (PML = APL; offiziell AML-M3) wird aufgrund einer charakteristischen Form der Blasten als Untergruppe der akuten myeloischen Leukämie (AML) definiert.
In der Mehrzahl der Fälle liegt eine chromosomale Translokation t(15;17) (q22;q21) vor, die zu dem Fusionstranskript PML-RARA führt. Der Nachweis der chromosomalen Translokation und/oder des Fusionstranskriptes ist diagnostisch beweisend. Andere molekulare Varianten sind eher selten.
Durch die Fusion des PML-Gens mit dem Retinsäure-Rezeptor A wird eine abweichende Genfunktion des Hybridproteins erzielt, nämlich eine Bindung an die Kern-DNA mit daraus folgender Blockierung von Transkriptionsprozessen und der blockierten Differenzierung von Granulozyten.

Indikation: V. a. akute Promyelozyten-Leukämie

Mutation: PML-RARA-Transfusion

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 2 Tage
Methode: PCR; Kapillarelektrophorese; Real-time-PCR

Gen(e): TCR-Locus
Erbgang: somatische Mutation


Klinische Bedeutung:

Patienten mit einer T-CLL sind i.d.R durch klonal rearrangierte T-cell-Rezeptoren charakterisiert. Das Auftreten von klonalen T-cell-Rezeptor-Fraktionen-beta, -gamma und -delta wird mittels Multiplex-PCR für TCR-spezifische Rearrangements getestet.
Klonale Fragmente weisen auf eine klonale Expansion atypischer T-Zellen im peripheren Blut hin. Ursächlich kommt die leukämische Ausschwemmung eines T-Zell-Lymphoms in Betracht.


Indikation: V. a. T-CLL

Mutation: Klonalitätsanalyse; TCR-Rearrangement; gem. BIOMED-2

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut

Dauer der Untersuchung: 1 – 2 Wochen

Methode: DNA-Extraktion; PCR; Fragmentanalyse; Kapillarelektrophorese

Gen(e): TET2
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Der Nachweis von Deletionen bzw. LOH im Bereich von Chromosom 4q24 bei einer größeren Kohorte von Patienten mit klinischer Diagnose MDS bzw. sogen. mixed MDS/MPN-Syndrom führten zur Identifizierung des TET2-Gens als betroffenem Gen. Neben Deletionen wurden heterozygote und homozygote Mutationen bei der Sequenzierung von entsprechenden klinischen Fällen gefunden. So zeigten u.a. 58 % der Patienten mit MDS/MPN-Syndrom und 10 % der MDS-Fälle TET2-Mutationen.
Die Methylcytosine dioxygenase TET2 katalysiert die Conversion von methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (hmC) mit einer postulierten Funktion in der Myelopoese durch Veränderung der Chromatinstruktur und somit für eine maligne Entwicklung der betroffenen Zellen. Bei Patienten mit myeloischen Erkrankungen ohne nachweisbare chromosomale Aberration kann ein Nachweis von TET2-Mutationen zum Monitoring des Krankheitsverlaufs eingesetzt werden. Die Prognose für betroffene Patienten wird in der Literatur als eher ungünstig angegeben.

Indikation: V. a. myelodysplastisches Syndrom (MDS); V.a. myeloloisch proliferative Neoplasie (MPN)

Mutation: TET2
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 3 Wochen
Methode: PCR; Next-Generation-Sequencing

Gen(e): TP53
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und nachgewiesener chromosomaler Deletion im Bereich 17p13 haben eine vergleichbar ungünstige Prognose gegenüber Patienten ohne entsprechende Chromosomenaberration. In dem chromosomalen Abschnitt 17p13 lokalisiert das Tumorsuppressorgen TP53. Während ca. 60 % der CLL-Patienten mit Deletion von 17p13 laut Literatur (Rossi et al., 2009) auch noch eine zusätzliche Mutation im nicht-deletierten TP53-Gen tragen und damit einen für die Prognose ungünstigen Komplettverlust bestätigen, finden sich in ca. 10 % der CLL-Fälle ohne chromosomale Deletion pathologische Punktmutationen, die den gleichen ungünstigen Effekt auf den Krankheitsverlauf zeigen. Insbesondere das Risiko einer Resistenz gegenüber einer Therapie mit Purin-Nukleosid-Analogen (z. B. Fludarabin) oder aliphatischen Wirkstoffen (z. B. Chlorambucil) ist hierbei von klinischer Relevanz.

Indikation: chronisch lymphatische Leukämie (CLL)

Mutation: TP53-Mutationsanalyse

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 2 – 5 Tage
Methode: PCR; Sequenzierung

Gen(e): WT1

Klinische Bedeutung:
Das Wilm’s Tumorgen WT1 ist ein Zinc-finger Transkriptionsfaktor, der ursprünglich als Kandidatengen für die Pathogenese des kindlichen Wilm’tumor beschrieben wurde. WT1 kann sowohl als Transkriptionsaktivator als auch als Transkriptionsrepressor fungieren. Für WT1 wurde weiterhin eine Überexpression in akuten und chronischen Leukämien beschrieben, deren funktionelle Bedeutung nicht vollständig geklärt ist. Generell dient der Nachweis einer WT1-Überexpression als ein Nachweis von leukämischen Zellen. So wird eine quantitative WT1-Testung oftmals als Monitor für den Nachweis einer minimal residual disease (MRD) eingesetzt, insbesondere in Fällen von AML, die keine chromosomalen Aberrationen zeigen. Ein früher Rückgang der WT1-Kopienzahl wird allgemein mit einer günstigeren Prognose verbunden.

Indikation: V. a. akute lymphoblastische Leukämie (ALL)

Mutation: WT1-Überexpression

Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-time-PCR

Gen(e): ZNF198-FGFR1
Erbgang: i. d. R. somatische Mutation

Klinische Bedeutung:
Das Stem cell leukemia/lymphoma (SCLL) Syndrome, auch als 8p11 myeloproliferatives Syndrom beschrieben, stellt nach WHO-Definition eine myeloide und lymphoide Neoplasie mit FGFR1-Aberration dar.
Durch eine charakteristische Chromosomentranslokation t(8;13)(p11;q11-12) kommt es zu einer Fusion des 5’-Bereichs des Zinc-finger-Transkriptionsfaktors ZNF198 mit dem 3’-Bereich des FGFR1-Gens (fibroblast growth factor receptor 1). Hierdurch werden im Fusionsprotein ZNF198-FGFR1 4-10 Zinc-finger-Domänen und die sogen. Prolin-reiche Region von ZNF198 mit dem intrazellulären Anteil der FGFR1 Rezeptor-Tyrosinkinase fusioniert. Dieses Fusionsprotein vermag mit sich selbst zu oligomerisieren und hierdurch die Tyrosinkinasedomäne konstitutiv zu aktivieren und u.a. über den STAT-Signalweg Proliferationssignale zu senden.

Indikation:
V. a. myelodysplastisches Syndrom (MDS)
V. a. myeloloisch poliferative Neoplasie (MPN)

Mutation: ZNF198-FGFR1
Material: 2 – 5 ml EDTA-Blut
Dauer der Untersuchung: ca. 1 – 3 Tage
Methode: PCR; Real-time-PCR