Molekularpathologie — Nachweisverfahren

Während der Pathogenese des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC), insbesondere bei Nichtrauchern, kann es in ca. 10 % der Fälle (je nach Studie schwanken die Daten zwischen 6 % und 15 %) zu einem doppelten Bruchereignis mit Inversion auf dem Chromosom 2, inv2(p21-p23), kommen. Dabei wird die ALK-Tyrosinkinase-Domäne unter Regulation des Fusionspartners EML4, einem konstitutiven Protein, dauerhaft exprimiert und es kommt zu einer Proliferation der Zelle. Gezielte ALK-Tyrosinkinase-Inhibitoren, wie z. B. Crizotinib, können die Zellproliferation wirksam reduzieren und das progressionsfreie Überleben signifikant steigern.

Neben EML4 sind auch Fusionen von ALK mit den Genen TFG und KIF5B beschrieben. EML4-ALK-Fusionen treten selten zusammen mit Mutationen in den Genen K-RAS oder EGFR auf.

Der Nachweis einer somatischen, aktivierenden EGFR-Mutation im Tumorgewebe, z. B. von Patienten mit einem lokal fortgeschrittenen oder metastasierten nicht-kleinzelligen (NSCLC) Bronchialkarzinom, ist eine Indikation für eine Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) der neuen Generation (z.B. Gefitinib). Dies betrifft ca. 10-17 % aller Lungentumore. Die Tyrosinkinasehemmer binden intrazellulär an die aktivierte Tyrosinkinase-Domäne und hemmen die nachfolgende Signalkaskade und blockieren somit die Tumorproliferation. Mutations-Hotspots finden sich in den Exonen 18-21 des EGFR-Gens, die gezielt auf das Vorliegen einer somatischen Mutation analysiert werden.   

Das KRAS-Gen gehört zu den häufig somatisch mutierten Genen in diversen humanen Tumoren. Insbesondere den Codons 12, 13 und 61 kommt eine pathogene Funktion zu. So führen somatische Mutationen in diesen Codons zu einer konsti-tutiven Aktivierung des KRAS-Gens und damit des RAS/RAF/MEK/ERK-Signalweges unter Ausschluss einer Regulation durch EGFR. Als Konsequenz zeigt eine anti-EGFR-Therapie daher kaum eine Wirkung.

ACHTUNG: Die Testung auf KRAS-Mutationen sollte nach allgemeinen Empfehlungen immer zusammen mit der Mutationsanalyse des NRAS-Gens erfolgen, da beide Gene in den therapeutischen Pathway eingreifen.

Wie auch das schon genannte KRAS-Gen gehört auch NRAS zu den häufig somatisch mutierten Genen in diversen humanen Tumoren. Insbesondere den Codons 12, 13 und 61 kommt eine pathogene Funktion zu. So führen somatische Mutationen in diesen Codons zu einer konstitutiven Aktivierung des NRAS-Gens und damit des RAS/RAF/MEK/ERK-Signalweges unter Ausschluss einer Regulation durch EGFR. Als Konsequenz zeigt eine anti-EGFR-Therapie daher kaum eine Wirkung.

ACHTUNG: Die Testung auf NRAS-Mutationen sollte nach allgemeinen Empfehlungen immer zusammen mit der Mutationsanalyse des KRAS-Gens erfolgen, da beide Gene in den therapeutischen Pathway eingreifen.

Die Tyrosinkinase cKIT (auch: CD117, Stammzellfaktor-Rezeptor) gehört zu den membranständigen Tyrosinkinase-Rezeptoren, die, wenn aktiviert, in der zellulären Signalkaskade eine Proliferation der Zelle fördern. Es sind im cKIT-Gen aktivierende Hotspotmutationen in den Exonen 9, 11, 13 und 17 bekannt, die mit einem Zellwachstum korrelieren und das Ansprechen einer Behandlung mit einem Tyrosinkinase-Inhibitor zeigen. Dies gilt insbesondere bei gastro-intestinalen Stromatumoren (GIST) oder auch malignen Melanomen.

Patienten mit einer erworbenen systemischen Mastozytose (SM) weisen als diagnostisches Kriterium meist die aktivierende cKIT-Mutation p.D816V auf, die zu einer Imatinib-Resistenz führen, so dass andere TKI-Medikamente ggf.  eingesetzt werden müssen.

Die meisten Gastrointestinalen Stromatumore (GISTs) sind molekular durch eine Mutation im Gen für den Tyrosinkinase-Rezeptor cKIT charakterisiert. Neben dieser Hauptgruppe existiert eine zweite, jedoch wesentlich kleinere Entität von schätzungsweise 11-12% aller Fälle, die in dem Gen für den homologen Kinaserezeptor Platelet derived growth factor receptor alpha (PDGFRA) Mutationen aufzeigen. Die Mehrzahl der GIST-Tumore aus dieser Gruppe haben Mutationen im Exon 18, insbesondere der Hotspotbereich um Codon p.D842 des PDGFRA-Gens, die z.B. eine Resistenz gegenüber einer Behandlung mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib zeigen.

HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) ist ein Mitglied der Familie membranständiger epidermaler Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) und stimuliert über den RAS-MAP-Kinase-Signalweg die Zellproliferation und hemmt gleichzeitig den programmierten Zelltod (Apoptose) über den mTOR-Signalweg. In einem signifikanten Anteil (ca. 19%) an Karzinomen/ Adenokarzinomen des Magens und der gastro-ösophagealen Junktionszone, wie auch in einem signifikanten Anteil (ca. 20%) der invasiv duktalen Mammakarzinome kann eine Amplifikation des HER2-Gens nachgewiesen werden. In diesen Fällen ist meist auch eine Überexpression des Proteins auf der Oberfläche der Tumorzellen mittels immunhistochemischer Methoden detektierbar. Die Überexpression des Her2-Proteins korreliert mit schnellem Tumorwachstum und einer schlechten Überlebensprognose. Eine gegen das exprimierte Protein gerichtete Therapie mit dem monoklonalen anti-HER2-Antikörper Trastuzumab senkt das Rezidivrisiko und verlängert die Überlebenszeit. Voraussetzung dieser Therapie ist der Nachweis einer Überexpression von Her2 auf Proteinebene, d.h. dass Patienten einen immunhistochemischen Score IHC = 3 oder bei IHC =2 zusätzlich konkordant auch einen mittels Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung (FiSH) nachgewiesenen Amplifikationsscore von >2 zeigen.

Das Gen BRAF kodiert für die Serin-Threonin-Proteinkinase B-raf mit funktioneller Bedeutung im MAP-Kinase- und im Ras-Raf-Signalweg für eine Wachstumsregulation der Zelle. Durch eine rel. häufige Mutation mit Austausch der Aminosäure Valin in Position V600 im BRAF-Gen wird die B-raf-Kinaseaktivität konstitutiv hochreguliert, so dass intrazellulär eine Signalkaskade zum unkontrolliertem Zellwachstum konstitutiv aktiviert wird. BRAF-Mutationen finden sich in diversen Tumoren.

Bei nachgewiesener BRAF-Mutation in Position p.Val600 wird der therapeutische Einsatz eines spezifischen B-raf-Inhibitors (z.B. Sorafenib, Vemurafenib) empfohlen, der bei unmutierten Fällen jedoch keine Wirkung zeigen sollte.

Fast die Hälfte der Patienten mit einem diagnostizierten kolorektalen Karzinom zeigt Mutationen im Tumorsuppressorgen TP53. Ein allelischer Verlust einer Kopie des TP53-Gens, zusammen mit einer unabhängig erworbenen TP53 Sequenzmutation, führt zu oftmals einer bi-allelischen Inaktivierung und damit zu einem Totalausfall der Tumorsuppressor-Eigenschaften. Hierbei zeigen Karzinome im distalen Kolon sowie im Rectum nach Literaturangaben höhere Mutationsfrequenzen als Karzinome im proximalen Kolon oder solche mit einer diagnostizierten Mikrosatelliten-Instabilität. Für das Ansprechen einer 5-Fluorouracil (5-FU)-basierenden Chemotherapie ist ein unmutierter Status erforderlich. Die Prognose bei Nachweis einer TP53-Mutation ist eher ungünstig zu werten. Für eine aussagekräftige Diagnostik sollte an Tumormaterial sowohl ein Test auf Verlust eines Allels des TP53-Gens (LOH; = loss-of-heterosigosity), wie auch eine Mutationsanalyse durch Sequenzierung durchgeführt werden.

Wesentliches Kriterium für das Vorliegen eines hereditären Colon-Karzinoms vom Typ HNPCC ist der Nachweis einer sogen. Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) in den betroffenen Tumorzellen. Hintergrund ist, dass bei HNPCC ein genetischer Defekt in DNA-Repair-Genen vorliegt, der wiederum bei der DNA-Replikation zu Lesefehlern in zufällig betroffenen Genen wie auch in den repetitiven Bereichen der Mikrosatelliten führt. Eine Veränderung der Mikrosatelliten-Fragmentlänge gegenüber normalen Zellen, sogen. Mikrosatelliten-Instabilität (MSI), fungiert dabei als diagnostischer Hinweis auf eine Störung des DNA-Reparatursystems.

Eine Aussage zur MSI ist nur aussagekräftig, wenn auch obligat zum Vergleich normales Gewebe/DNA getestet wird, welches entweder aus den unauffälligen Resektionsrändern oder z.B. aus dem peripheren Blut gewonnen wird.

Zur Auswertung werden die Fragment-Profile der normalen DNA mit denen der Tumorzellen verglichen und nach folgenden Kategorien ausgewertet:

MSI-high = MSI in > der getesteten Mikrosatelliten nachweisbar

MSI-low = MSI in nur einem der getesteten Mikrosatelliten nachweisbar

MS-stable= keine MSI in den getesteten Mikrosatelliten nachweisbar

Das medulläre Schilddrüsenkarzinom ist eine von den C-Zellen der Schilddrüse ausgehende Form des Schilddrüsenkarzinoms und repräsentiert ungefähr 5% aller Fälle von Schilddrüsenkarzinomen. Es tritt zu ca. 80% sporadisch auf, während es sich in ungefähr 20% dieser Fälle um ein MEN2-Syndrom handelt, das zu einer multiplen endokrinen Neoplasie prädisponieren und zu hormonellen Überfunktionen führen kann. Während das MEN2-Syndrom familiär erblich ist und bereits in einem frühen Lebensalter (junge Erwachsene) auftritt, treten sporadische Formen meist im Alter (> 50) und sind eher solitär.

Ursächlich für die Entwicklung eines MEN2a-Syndroms sind aktivierende Mutationen im RET-Proto-Onkogen, einem Tyrosinkinase-Rezeptor. Die Diagnosestellung einer RET-Mutation ist aufgrund der Erblichkeit von besonderer Bedeutung für eine prädiktive Diagnostik der Familienangehörigen, denen so eine engmaschige Kontrolle und gegebenenfalls eine prophylaktische Thyreoidektomie ermöglicht werden kann.

Das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) ist mit ca. 80 % die mit Abstand häufigste Form des Schilddrüsenkarzinoms. Bei klinischem Verdacht und /oder einem hinter-fragten chirurgischen Eingriff wird meist eine Feinnadelbiopsie (FNAB) durchgeführt, um mögliche Knötchen einer eingehenden pathologischen Untersuchung zuzuführen. Ist das cytologische Ergebnis nicht eindeutig, so sollte eine molekulare Analyse für ein Panel der häufigsten somatischen Mutationen durchgeführt werden. Für das papilläre Schilddrüsenkarzinom werden mit Abstand am häufigsten (13-43 %) die sogen. RET-PTC-Rearrangements gefunden, die aufgrund einer Inversion oder chromosomalen Translokation zu einer konstitutiven Aktivierung der RET Tyrosinkinasedomäne und damit zu einer dauerhaften Signalkaskade des MAPK-Signalwegs mit unkontrollierter Proliferation der betroffenen Zellen führen. Verschiedene Rearrangements sind beschrieben, wobei am häufigsten die Subtypen RET-PTC1 und RET-PTC3 betroffen sind.

Tumorzellen zeigen allgemein eine chromosomale Instabilität. Untersuchungen haben gezeigt, dass bei Urothelkarzinomen besonders häufig Vermehrungen (Polysomie) der Chromosomen 3, 7 und 17 beobachtet werden, und dass bereits in der Frühphase der Tumorentstehung Verluste vom Chromosom 9 und des 9p21-Locus, der das p16-Tumorsuppressor-Gen enthält, gefunden werden können.

Die hohe Rezidiv- und Progressionsrate der Urothelkarzinome bedingt die Notwendigkeit einer konsequenten und engmaschigen Nachsorge, die in definierten Zeitabständen lebenslang durchgeführt werden muss. Zur Erkennung von Tumorrezidiven werden vorrangig Zystoskopie und Urinzytologie herangezogen. Mit Hilfe der Fluoreszenz- in situ- Hybridisierung (FISH; Urovysion-Test), die eine Visualisierung und Quantifizierung von Chromosomen oder spezifischen Genloci an Interphase-Zellkernen mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden ermöglicht, werden die Urothelzellen bezüglich karzinomassoziierter Chromosomenaberrationen beurteilt.

In der überwiegenden Mehrzahl aller Fälle von Gebärmutterhalskrebs-Erkrankung ist eine persistierende Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV) ein auslösender Faktor. Über 80 % aller HPV-Infektionen sind transient/passager und innerhalb eines Zeitraums von 2 Jahren wieder verschwunden. Es sind unterschiedliche Genotypen der humanen Papillomaviren mit unterschiedlichen Risiken für Gebärmutterhalskrebs beschrieben worden, mit einer Kategorisierung in sogen. Hochrisiko-Typen (high-risk) und Niedrigrisiko-Typen (low-risk).

Etwa 25 % der oralen Plattenepithelkarzinome sind ebenfalls mit humanen Papilloma Viren (HPV) assoziiert. Diese verhalten sich im Vergleich zu den Tumoren ohne HPV Belastung gutartiger. Neben den bekannten High-Risk-HPV-Subtypen 16 und 18 sind mittlerweile eine Reihe weiterer potenziell karzinogener Subtypen (HPV 33–35, 44, 45, 53 und andere) identifiziert worden.

Zu den potentiell krebserregenden Hochrisiko-Typen zählen unter anderem die Genotypen HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, und 82. Mittels einer Chip-basierten Typisierung können diese HPV-Subtypen sicher identifiziert und berichtet werden.

Numerische Chromosomenaberrationen stellen mit ca. 45% die häufigsten Ursachen für Spontanaborte im ersten Schwangerschaftstrimenon dar. Wo möglich, kann fetales Abortgewebe kultiviert und mittels einer konstitutionellen Chromosomenanalyse auf chromosomale Auffälligkeiten hin analysiert werden. Ist das Geweb einer Zellkultur nicht mehr zugänglich, kann mittels Mikrosatelliten-PCR für die bei Aborten mit Abstand am häufigsten gefundenen trisomen Chromosomen, nämlich Chromosom 7, 8, 13, 15, 16, 18, 21, 22, X und Y, eine Analyse durchgeführt werden.

Die Array-CGH ist eine Chip-Technologie, die mit einer höheren Auflösung, als die konventionelle Chromosomenanalyse submikroskopische, unbalancierte Veränderungen, wie z.B. Mikrodeletionen, zu detektieren vermag.Die von uns durchgeführte Array-CGH ist begrenzt durch das Auflösungsvermögen des eingesetzten Arrays. So werden Imbalancen, die kleiner als 100kb sind, nicht oder nur unzureichend detektiert. Methodisch wird bei der Array-CGH die DNA des Patientenmaterials mit einer Kontroll-DNA hybridisiert, wobei Abschnitte mit einer Imbalance mittels einer spezifischen Fluoreszenzfarbmarkierung als Zugewinn oder Verlust von chromosomalen Abschnitten der Patienten-DNA bewertet werden.

(*) Mittels der neuen Technik des Next-Generation-Sequencing (NGS) können individuell zusammengestellte Gene (d. h. auch nach Wünschen des Einsenders) im Genom des Patienten auf Mutationen im unteren Prozentbereich getestet werden. Derzeit stehen ein sogen. Cancer-Patho-Panel und ein sogen. Hämato-Onco-Panel mit den wichtigsten Genen bzw. Hotspotmutationen zur Verfügung.

Bei Interesse bitte telefonische Rücksprache, da diese Methode nach EBM derzeit leider nicht abrechenbar ist!